Introducción

Los péptidos desempeñan un papel importante en los biofármacos, con un interés creciente en su uso para el desarrollo de medicamentos. Actualmente, más de 80 fármacos basados en péptidos han sido aprobados para uso clínico en todo el mundo. Dado que estos productos se utilizan para tratar enfermedades, requieren una regulación exhaustiva para demostrar que no solo son efectivos, sino también seguros. Por lo tanto, caracterizar con precisión estos péptidos es necesario para el desarrollo de biofármacos. La caracterización de biofármacos y la verificación de su estabilidad son esenciales para garantizar la eficacia, seguridad y eficiencia de los medicamentos, asegurando así la calidad deseada del producto.

La bradicinina es un péptido compuesto por nueve aminoácidos (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) que provoca vasodilatación, por lo que se utiliza para reducir la presión arterial. La bradicinina tiene un peso molecular (Mw) de 1061 Da y un radio hidrodinámico (Rh) inferior a 0.8 nm. Su pequeño tamaño puede dificultar el análisis mediante SEC; sin embargo, esto no representa un obstáculo para la caracterización con el sistema de detección múltiple OMNISEC.

La alta sensibilidad del sistema de detección múltiple OMNISEC permite una caracterización mejorada de moléculas pequeñas que previamente pasaban desapercibidas durante el análisis por SEC. En esta nota de aplicación, verá cómo puede utilizar el sistema OMNISEC para analizar péptidos, específicamente la bradicinina, con alta precisión. El análisis de detección múltiple de OMNISEC puede aplicarse a muchos otros péptidos o polímeros pequeños, además del ejemplo específico discutido aquí. Si desea saber si esto es aplicable a su muestra, contáctenos aquí. (Lnk a cas-instrumental)

Caracterización mediante detección múltiple para mejorar el análisis de muestras

El sistema OMNISEC de Malvern Panalytical incluye un módulo de separación, OMNISEC RESOLVE, y un módulo de detección múltiple, OMNISEC REVEAL, que contiene: un detector de índice de refracción (RI), un detector UV/Vis PDA, un detector de dispersión de luz a ánguloa 90° y bajo (RALS/LALS) y un viscosímetro diferencial. Mediante la detección múltiple, las múltiples mediciones realizadas en nuestras muestras de manera simultánea generan una gran cantidad de información, mejorando la caracterización de las muestras.

Más información sobre la detección múltiple y cómo funcionan los detectores puede encontrarse en el documento técnico: Detección triple GPC/SEC: Principios y metodología | Malvern Panalytical.

Un parámetro importante que debe considerarse al analizar muestras mediante detección múltiple es el valor de dn/dc de las mismas. El dn/dc es el incremento del índice de refracción y es necesario para calcular la concentración y el peso molecular absoluto (Mw) de una muestra. El dn/dc de diferentes muestras se encuentra a menudo en la literatura. Sin embargo, lo que complica el análisis de los péptidos es que, típicamente, es difícil definir su dn/dc, a diferencia de las proteínas, cuyo valor de dn/dc se conoce como 0.185 mL/g en condiciones acuosas. No obstante, utilizando el detector RI de OMNISEC, se calculó que el dn/dc de la bradicinina es de 0.21 mL/g en condiciones acuosas. Este valor se utilizó para calcular el Mw de las muestras.

¿Cuánto es suficiente para caracterizar?

En el mundo de los biofármacos, las muestras suelen ser muy valiosas y se dispone de cantidades limitadas para su caracterización, especialmente para la caracterización exhaustiva que requieren los productos farmacéuticos. Poder analizar algo tan pequeño como 1000 Da no resulta muy útil si se necesitan miligramos de muestra para obtener una respuesta adecuada de los detectores para una caracterización completa. Afortunadamente, gracias a la sensibilidad mejorada de los detectores del sistema OMNISEC, se necesitan volúmenes de muestra muy pequeños para caracterizarla con precisión.

Se realizaron una serie de inyecciones en el sistema OMNISEC con 5 μg, 25 μg y 50 μg de bradicinina. Las respuestas de los detectores para estas tres cantidades de inyección se muestran en la Figura 1, y los resultados cuantitativos de las muestras se presentan en la Tabla 1.

Al inyectar tan solo 5 μg de muestra, las señales de los detectores RALS y RI fueron lo suficientemente intensas para caracterizar con precisión el peso molecular del péptido. Una inyección de solo 25 μg fue suficiente para obtener respuestas adecuadas en todos los detectores, lo que permitió una caracterización completa de la muestra, incluyendo el cálculo del peso molecular (Mw), viscosidad intrínseca (IV) y tamaño en términos de radio hidrodinámico (Rh).

Aumentar la cantidad de muestra inyectada a 50 μg no fue necesario para obtener resultados más precisos o adicionales, pero generó picos de respuesta de muestra más claros en los cromatogramas de todos los detectores.

Figure 1: OMNISEC multi-detector chromatograms of Bradykinin resulting from 5 μg, 25 μg, and 50 μg of sample loading. Shown in each plot are the RI (red), RALS (green) and Viscometer (blue) sample chromatograms, overlayed with the derived data for Mw (brown), intrinsic viscosity (Blue) and Rh (grey).

Table 1: Quantitative characterisation of three sample loadings of Bradykinin, 50 μg, 25 μg, and 5 μg.

Agregación de péptidos

La agregación de péptidos o proteínas puede desencadenar una mayor respuesta inmunitaria. Por lo tanto, la estabilidad y los niveles de agregados en los biológicos son de gran preocupación durante el desarrollo del producto final, ya que pueden afectar su eficacia e inmunogenicidad. El análisis de la agregación de bioterapéuticos es necesario para evaluar la estabilidad de los productos farmacéuticos.

La bradicinina tiende a autoasociarse en PBS a pH 7 con el tiempo. Para evaluar su estabilidad, se dejaron varias alícuotas de muestra durante 5 semanas a temperatura ambiente en PBS antes de su caracterización utilizando el sistema OMNISEC. Los resultados se compararon con muestras nuevas de bradicinina para determinar el efecto del tiempo y el estrés en las características moleculares de las muestras.

Superponer los cromatogramas de la bradicinina nueva y la bradicinina envejecida permite observar los cambios en la muestra. El cromatograma RI (Figura 2A) inicialmente no muestra indicios significativos de cambio entre las muestras nuevas y envejecidas de bradicinina. Sin embargo, al hacer zoom en el volumen de retención (RV) de 6 a 8 mL, se observa un pico claro (aproximadamente 9 mV) en la muestra envejecida que no está presente en la muestra nueva. Este pico en un RV tan bajo indica la presencia de una población de partículas de gran tamaño atribuible a agregados en la muestra.

La presencia de agregados grandes es mucho más evidente con el detector RALS (Figura 2B), que muestra claramente un pico intenso (aproximadamente 40 mV) ausente en la muestra nueva de bradicinina. Esto resalta el valor del detector de dispersión de luz (LS), que puede detectar claramente la presencia de especies de alto peso molecular, incluso cuando están en concentraciones muy bajas.

Figure 2. Overlay of RI (a) and RALS (b) chromatograms for the new Bradykinin sample (purple) and the old Bradykinin sample that had been stressed for 5 weeks at room temperature (red).

Cromatograma de detección múltiple

El cromatograma de detección múltiple en la Figura 3 muestra los datos sin procesar de la bradicinina envejecida tras someterla a estrés, revelando dos poblaciones distintas dentro de la muestra.

• El segundo pico, en un volumen de retención (RV) de 17 mL, se caracterizó como el péptido bradicinina con un peso molecular (Mw) de 1047 Da.
• El primer pico, en un RV de 7 mL, se caracterizó con un Mw de 2 MDa.
  

Los resultados cuantitativos se presentan en la Tabla 2. Los datos indican que, a pesar de la baja concentración de agregados, fue posible cuantificar su cantidad y caracterizarlos. Los resultados mostraron que el 0.7 % de la muestra inyectada se identificó como agregados.

Figure 3. Multi-detector chromatogram of 5-week stressed Bradykinin sample overlayed with the derived Mw and Rh data.

Table 2: Quantitative characterisation of 5-week stressed Bradykinin

Conclusiones

En este estudio, el análisis SEC con detección múltiple ha demostrado ser una herramienta valiosa para el análisis de pequeños péptidos. El sistema OMNISEC de Malvern Panalytical se utilizó con éxito para caracterizar la bradicinina, un péptido pequeño de 1000 Da.

Se requirieron tan solo 5 μg de bradicinina para una caracterización precisa del peso molecular (Mw), y con apenas 25 μg de muestra se logró una caracterización completa de Mw, viscosidad intrínseca (IV) y radio hidrodinámico (Rh), gracias a la alta sensibilidad de los detectores del sistema OMNISEC.

Como se demostró, también fue posible caracterizar la agregación en muestras sometidas a estrés, destacando el valor particular de los detectores LS por su alta sensibilidad a poblaciones de alto Mw dentro de una muestra.